• PCR±ê×¼²Ù×÷Á÷³Ì

    Ïà¹Ø×ÊÁÏ£ºPCRÎÊÌâ¼°Ìá¸ßPCRÌØÒìÐÔ·½·¨×ܽá

    ±¾ÎĽéÉÜÁËPCRµÄÏêϸ²Ù×÷Á÷³Ì£¬Ç¿µ÷ÁËʵÑéÖеÄ×¢ÒâÊÂÏÁоÙÁ˳£Óûº³åÒºµÄÅä·½¡£°ïÖú½ðÄê»á¡¤(jinnian½ðÄê»á)ÔÚÀí½âʵÑéµÄ»ù´¡Éϸü˳ÀûµÄ²Ù×÷¡£

    ¾ÛºÏøÁ´Ê½·´Ó¦£¨Polymerase Chain Reaction£¬PCR£©ÊÇÌåÍâºÏ³ÉË«Á´DNAµÄÒ»ÖÖ·½·¨£¬ÆäÔ­ÀíÀàËÆÓÚÌìÈ»DNAµÄ¸´Öƹý³Ì£¬ÆäÌØÒìÐÔÖ÷ÒªÒÀÀµÓÚÓëÆäÄ¿µÄƬ¶ÎÁ½¶Ë»¥²¹µÄÌØÒìÒýÎïºÍ¸ßÌØÒìÐÔµÄø¡£µäÐ͵ÄPCR·´Ó¦ÓÐÈý¸ö²½Ö裺±äÐÔ£¬ÍË»ð£¬ÑÓÉ죬¾­¹ý¶à´ÎÑ­»··´Ó¦£¬»ñµÃÄ¿µÄƬ¶Î¡£

    Ò»£®ÊÔ¼Á×¼±¸

    1. DNAÄ£°å
    2. ÌØÒìÐÔÒýÎï
    3. dNTP Mix
    4. PCR buffer
    5. ÈÈÆô¶¯Ã¸

    ¶þ£®²Ù×÷²½Öè

    1.ÅäÖ÷´Ó¦Ìåϵ

    ½«¸÷³É·ÖÒÀ´Î¼ÓÈëµ½0.5mlµÄÀëÐĹÜÖÐ

    ÊÔ¼Á ÖÕŨ¶È
    buffer 1x
    dNTPs <0.4mM
    Forward primer <0.4uM
    Reverse primer <0.4uM
    Template DNA <100ng
    ÈÈÆô¶¯Ã¸ 5U
    ddH2O Up to 50 ul

    À©ÔöʹÓÃÈÈÆô¶¯Ã¸£¬¿ÉÔÚ³£ÎÂϲÙ×÷£¬·ÇÈÈÆô¶¯Ð͵ÄøҪÔÚµÍÎÂÅäÖ÷´Ó¦Ìåϵ¡£

    2.°´ÕÕÊÔ¼ÁºÐ˵Ã÷ÊéÉèÖ÷´Ó¦Ê±¼äºÍζȣ¬À©Ôö½áÊøºóµçÓ¾¼ø¶¨

    3.ÇíÖ¬ÌǺËËáµçÓ¾

    • ½«µçÓ¾ËùÓÃÆ÷¾ßÕôÁóˮϴ¾»£¬¼ÜºÃÊá×Ó
    • ¸ù¾ÝÒª·ÖÀëµÄDNAƬ¶Î´óСÖƱ¸ºÏÊÊŨ¶ÈµÄÇíÖ¬ÌÇÄý½º£¬×¼È·³ÆÈ¡Ò»¶¨µÄÇíÖ¬ÌǼÓÈ뵽׶ÐÎÆ¿ÖУ¬¼ÓÈë30ml×óÓҵĵçÓ¾»º³åÒº£¨TAE»òTBE£©
    • ÔÚ΢²¨Â¯ÖмÓÈÈÈÚ»¯ºóÀäÈ´ÖÁ40¡æ×óÓÒ£¬³ä·Ö»ìÔȺóµ¹ÈëµçÓ¾²ÛÖÐ
    • ÊÒÎÂÏÂÄý¹Ì40·ÖÖÓ×óÓÒ£¬Ð¡ÐİγöÊá×Ó£¬½«Äý½º·ÅÖõçÓ¾²ÛÖÐ×¼±¸µãÑù
    • ÔÚµçÓ¾²ÛÖмÓÈëµçÓ¾»º³åÒº£¬Âþ¹ýÄý½º±íÃæ¼´¿É£¬µãÑù¿×ÄÚ²»ÒªÓÐÆøÅÝ
    • ÑùÆ·µãÑùÇ°×¼±¸ºÃ£¬£¨ÔÚ°ËÁ¬¹ÜÖУ©¼ÓÈë5ulÑùÆ·£¬1ulµÄ6xLoding bufferºÍ1ulµÄȾÁÏ»ìºÏ£¬ÓÃÇÀ½«»ìºÏºóµÄÑùÆ·»º»º×¢Èëµ½µãÑù¿×ÖУ¬×¢Òâ²»Òª´®¿×
    • °´ÕÕÕý¸º¼«£¨ºìÕýºÚ¸º£©£¬½ÓͨµçÔ´£¬µçѹ40-60V£¬Ê±¼ä30-40min£¬¿É¸ù¾Ýäå·ÓÀ¶µÄλÖÃÅжÏÊÇ·ñÖÕÖ¹µçÓ¾
    • µçÓ¾½áÊø£¬¹Ø±ÕµçÔ´£¬Äý½º³ÉÏñ¹Û²ì£¬²¢¶Ô±ÈmarkerÈ·¶¨Æ¬¶Î´óС

    ²»Í¬µÄÇíÖ¬ÌÇŨ¶È·ÖÀ벻ͬ´óСµÄDNAƬ¶Î£º

    ÇíÖ¬ÌǵÄŨ¶È/% 0.3 0.5 0.7 1.0 1.2 1.5 2.0
    DNA´óС/kb 5-60 1-30 0.8-12 0.5-10 0.4-7 0.2-3 0.05-2

    Èý£®×¢ÒâÊÂÏî

    ÒýÎï

    ÒýÎïÊǾö¶¨PCR·´Ó¦³É°ÜµÄ¹Ø¼ü£¬Òª±£Ö¤À©ÔöµÄ׼ȷ¡¢¸ßЧ£¬ÒýÎïµÄÉè¼ÆÒª×ñÑ­ÈçÏÂÔ­Ôò£º

    1. ÒýÎïµÄÉè¼ÆÔÚcDNAµÄ±£ÊØÇøÓò£¬ÔÚNCBIÉÏËÑË÷²»Í¬ÎïÖÖµÄͬһ»ùÒò£¬Í¨¹ýÐòÁзÖÎöµÄÈí¼þ£¬µÃµ½²»Í¬»ùÒòÏàͬµÄÐòÁоÍÊǸûùÒòµÄ±£ÊØÇø
    2. ÒýÎïµÄ³¤¶È£º15-28bp£¬³¤¶È´óÓÚ38bp£¬»áʹÍË»ðζÈÉý¸ß£¬²»ÀûÓÚÆÕͨTaqøµÄÀ©Ôö
    3. ÒýÎïGCº¬Á¿ÔÚ40%-60%£¬TmÖµ×îºÃ½Ó½ü72¡æ
    4. ÒòÃÜÂë×ӵļò²¢ÐÔ£¬ÒýÎïµÄ3¡¯¶Ë×îºÃ±Ü¿ªÃÜÂë×ӵĵÚÈý루×îºÃΪT£©
    5. ¼î»ù·Ö²¼´íÂäÓÐÖ£¬3¡¯¶Ë²»³¬¹ý3¸öÁ¬ÐøG»òC
    6. ÒýÎï×ÔÉí²»ÒªÐγɷ¢¼Ð½á¹¹£¬ÒýÎïÉè¼ÆÍê³É£¬ÒªBLASTÑéÖ¤

    Ä£°å

    PCRÀ©Ôö¶ÔÄ£°åµÄÒªÇ󲻸ߣ¬µ¥Á´¡¢Ë«Á´DNA¾ù¿É×÷ΪÀ©ÔöƬ¶Î£¬ËäÈ»PCRÄܹ»À©Ôö΢Á¿µÄDNA£¬ÎªÁ˱£Ö¤À©ÔöµÄÌØÒìÐÔ£¬¶Ô²»Í¬À´Ô´µÄÄ£°å£¬ÆðʼŨ¶ÈÓÐÒ»¶¨ÒªÇó£¬ÈçÏ£º

    Ä£°å ¼ÓÈëÁ¿
    ¦ËDNA 100pg-100ng
    ÖÊÁ£DNA 100pg-10ng
    ´ó³¦¸Ë¾ú»ùÒò×éDNA 100pg-100ng
    ÈËÀà»ùÒò×éDNA 10-200ng

    Ä£°å¿ÉÒÔÊÇ´¿»¯ºóµÄÑùÆ·Ò²¿ÉÒÔÊÇ´ÖÖÆÆ·£¬²»Í¬À´Ô´µÄÄ£°å²ÉÈ¡²»Í¬µÄ´¦Àí·½·¨£¬ÊµÑéÄ£°åµÄ´¿»¯Ô½¼òµ¥Ô½ºÃ£¬µ«Ä£°åÖÐÈç¹ûº¬ÓÐÈκεÄTaqøÒÖÖƼÁ¡¢µ°°×ø¡¢ºËËáøµÈ£¬»á¸ÉÈÅ·´Ó¦¡£Ä£°åÌáȡעÒâ±£´æ£¬²»ÄÜ·ÅÖÃÌ«¾Ã£¬±ÜÃâ·´¸´¶³ÈÚ²¢·ÀÖ¹½µ½â¡£¶àÊýÈË»áºöÂÔÕâÒ»ÎÊÌ⣬µ±ÊµÑé½á¹ûûÓÐÈκÎÌõ´øʱ£¬¿ÉÓÅÏÈ¿¼ÂÇÊÇ·ñΪģ°å½µ½âµÄÔ­Òò¡£

    ¾ÙÀý£ºÏ¸¾úDNAµÄÌáÈ¡·½·¨

    1. È¡1-2mlµÄ¾úÒº£¬12000rpmÀëÐÄ10min£¬È¥³ýÉÏÇ壬µÃµ½³Áµí
    2. ¸ù¾ÝµÃµ½³ÁµíÁ¿£¬¼ÓÈë500ul×óÓÒµÄTE£¨Åä·½ÈçÏ£©Ðü¸¡³Áµí£¬²¢¼ÓÈë20ulµÄÈܾúø£¬37¶È±£ÎÂ30min
    3. ¼ÓÈë30ul 10%µÄSDSºÍ1mgµ°°×øK£¬»ìÔȺó37¶È±£ÎÂ1h
    4. ¼ÓÈë120ul 5mol/lÂÈ»¯ÄÆ£¬³ä·Ö»ìÔÈ£¬65¶È·ÅÖÃ10min
    5. µÈÌå»ýµÄ·Ó£ºÂȷ£ºÒìÎì´¼£¨25:24:1£©³ä·Ö»ìÔÈ£¬12000rpmÀëÐÄ5min£¬µÃÉÏÇåÓڸɾ»µÄEP¹ÜÖÐ
    6. µÈÌå»ýµÄÂȷ£ºÒìÎì´¼£¨24:1£©³ä·Ö»ìÔÈ£¬12000rpmÀëÐÄ5min£¬µÃµ½ÉÏÇåÓڸϽôEP¹ÜÖÐ
    7. ¼ÓÈëµÈÌå»ýµÄÒìÎì´¼£¬³ä·Ö»ìÔÈ£¬-20¡æ·ÅÖÃ30minºó10000rpmÀëÐÄ5min
    8. È¥³ýÉÏÇ壬µÃµ½DNA³ÁµíÓÃ70%µÄÒÒ´¼Æ¯Ï´£¨¶¯×÷ÇáÈᣬ²»Òª½«³Áµí³åÆ𣩣¬Îü¸É£¬Í¨³£¿É»ñµÃ3-5ugµÄDNA

    ÆäËû

    1. Taq DNA¾ÛºÏø£ºTaqøÖÖÀàÓкܶ࣬ÈÈÆô¶¯Ã¸£¬¸ß±£Õæø£¬¸ù¾Ý¸÷×ÔʵÑéµÄÓ¦ÓÃÑ¡ÔñºÏÊʵÄøÀ©Ôö£¬Ò»°ãµÄ·´Ó¦£¬»¯Ñ§ÐÞÊεÄÈÈÆô¶¯Ã¸¼´ÄܺܺõÄÍê³É£¬»¯Ñ§ÐÞÊÎÈÈÆô¶¯Ã¸Äܹ»±ÜÃâµÍÎÂÏÂÈκηÇÌØÒìÐÔ²úÎï²úÉú¡£Ã¸µÄŨ¶È¶ÔÀ©ÔöÓÐÒ»¶¨Ó°Ï죬øÓÃÁ¿¹ý¶à£¬»áµ¼Ö·ÇÌØÒìÐÔ²úÎ²Ù×÷°´ÕÕ˵Ã÷Êé¼´¿É¡£
    2. dNTP£ºËÄÖÖdNTPµÄŨ¶ÈÒªÏàͬ£¬ÆäÖÐÈκÎÒ»ÖÖŨ¶ÈÆ«¸ß»òÆ«µÍ£¬¶¼»áÒý·¢¼î»ùµÄ´íÎóÉøÈë¡£´ËÍ⣬dNTPÄܹ»ºÍÌåϵÖÐþÀë×Ó½áºÏ£¬´Ó¶øÓ°ÏìÌåϵÖÐþÀë×ÓµÄŨ¶È¡£
    3. »º³åÒº£º»º³åÒºÒ»°ãËæøÌṩ£¬Ò»°ãµÄPCRÊÔ¼ÁºÐ°üÀ¨Taqø£¬»º³åÒº£¬dNTP£¬Ë®¡£³õ´ÎÀ©Ôö£¬¿ÉÒÔÍêÈ«°´ÕÕÊÔ¼ÁºÐµÄ˵Ã÷Êé²Ù×÷£¬Èç¹ûÀ©Ôö½á¹ûÓÐÎÊÌ⣬¿É×Ô¼º³¢ÊÔÃþË÷ʵÑéÌõ¼þ»òÖØÐÂÉè¼ÆÒýÎïÌáÈ¡Ä£°åÀ©Ôö¡£
    4. Òò¿ÕÆøÖкÍÊÖÉÏÓÐÒ»¶¨ÎÛȾԴ£¬²Ù×÷¹ý³ÌÖÐÒª´÷ÊÖÌ×£¬Ôڸɾ»µÄ»·¾³ÖÐÅäÖ÷´Ó¦Ìåϵ£¬·ÀÖ¹¿ÕÆøÖеÄÎÛȾԴ¡£
    5. PCRÀ©ÔöµÄˮҪ¾­¹ý¸ßѹÃð¾ú»ò0.2umÂËĤ¹ýÂË¡£
    6. ²úÎïÇнº»ØÊÕ¶þ´ÎÀ©ÔöÇ°£¬ÒªÏȼø¶¨£¬¶þ´ÎÀ©ÔöÄ£°åÏ¡ÊÍ1000±¶¡£

    ËÄ£®³£ÓÃÊÔ¼ÁÅä·½

    µçÓ¾»º³åÒº

      1. 50xTAE£¨pH8.5£©

    ׼ȷ³ÆÈ¡Tris 242g£¬EDTA£¨Na£©37.2gÓÚ1LÉÕ±­ÖУ¬¼ÓÈë800mlÈ¥Àë×ÓË®£¬½Á°èÈܽ⣬½ÓÈë57.1mlÒÒËᣬ³ä·Ö½Á°è£¬µ÷pHÖµ8.5ºó¶¨ÈÝÖÁ1L£¬ÊÒα£´æ¡£Ã¿´ÎʹÓÃʱϡÊͼ´¿É¡£

      1. 10xTBE£¨pH8.3£©

    ׼ȷ³ÆÈ¡Tris 108g£¬EDTA 7.44g ÅðËá55gÓÚ1LµÄÉÕ±­ÖУ¬¼Ó800mlÈ¥Àë×ÓË®£¬³ä·Ö½Á°èÈܽ⣬µ÷pH8.3ºó¶¨ÈÝÖÁ1L£¬ÊÒα£´æ¡£Ã¿´ÎʹÓÃÇ°Ï¡Êͼ´¿É¡£

    ÉÏÑù»º³åÒº

    6xLoding buffer

    0.25%¶þ¼×±½Ç࣬0.25%äå·ÓÀ¶£¬30%¸ÊÓÍÈÜÓÚË«ÕôË®ÖУ¬4¡æ±£´æ¡£

    Ïà¹Ø²úÆ·

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