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³£ÓõĿ¹Ìå±ê¼Ç¼¼Êõ

1.¿¹ÌåµÄø±ê¼Ç·¨

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1) À±¸ù¹ýÑõ»¯Îïø(HRP)

À±¸ù¹ýÑõ»¯Îïø£¨HRP£©±ê¼Çµ¥¿¹ºÍ¶à¿Ë¡¿¹ÌåµÄ³£Ó÷½·¨ÊǹýµâËáÄÆ·¨¡£ÆäÔ­ÀíÊÇHRPµÄÌÇ»ùÓùýµâËáÄÆÑõ»¯³ÉÈ©»ù£¬¼ÓÈ뿹ÌåIgGºó¸ÃÈ©»ùÓë IgG°±»ù½áºÏ£¬ÐγÉSchiffÊϼΪÁË·ÀÖ¹HRPÖÐÌǵÄÈ©»ùÓëÆä×ÔÉíµ°°×°±»ù·¢ÉúżºÏ£¬ÔÚÓùýµâËáÄÆÑõ»¯Ç°ÏÈÓöþÏõ»ù·ú±½×è¶Ï°±»ù¡£Ñõ»¯·´Ó¦Ä©ÁË£¬ÓÃÅðÇ⻯ÄÆÎȶ¨SchiffÊϼî¡£

²Ù×÷²½Ö裺
  • ½«5mg HRPÈÜÓÚ0.5ml 0.1mol/L NaHCO3ÈÜÒºÖУ»¼Ó0.5ml 10mmol/L NaIO4ÈÜÒº£¬»ìÔÈ£¬¸Ç½ôÆ¿Èû£¬ÊÒαܹâ×÷ÓÃ2Сʱ¡£
  • ¼Ó0.75ml 0.1mol/L Na2CO3»ìÔÈ¡£
  • ¼ÓÈë0.75mlСÊóÒÑ´¦ÀíµÄ¸¹Ë®£¬»ò´¿»¯µ¥¿¹µÈ£¨15mg/ml£©£¬»ìÔÈ¡£
  • ³ÆÈ¡Sephadex G25¸É·Û0.3g£¬¼ÓÈëһ֧Ͽڵ沣Á§ÃÞµÄ5ml×¢ÉäÆ÷ÍâͲÄÚ£»Ëæºó½«ÉÏÊö½»ÁªÎïÒÆÈë×¢ÉäÆ÷ÍâÌ×£»¸Ç½ô£¬ÊÒÎÂ×÷Ó㨱ܹ⣩3Сʱ»ò4¡æ¹ýÒ¹¡£
  • (ÓÃÉÙÐíPBS½«½»ÁªÎïÈ«²¿Ï´³ö£¬ÊÕ¼¯Ï´³öÒº£¬¼Ó1/20VÌå»ýÐÂÏÊÅäÖƵÄ5mg/ml NaBH4ÈÜÒº£¬»ìÔÈ£¬ÊÒÎÂ×÷ÓÃ30·ÖÖÓ£»ÔÙ¼ÓÈë3/20V NaBH4ÈÜÒº£¬»ìÔÈ£¬ÊÒÎÂ×÷ÓÃ1Сʱ£¨»ò4¡æ¹ýÒ¹£©¡£
  • ½«½»ÁªÎï¹ýSephadex G200»òSepharose 6B£¨2.6¡Á50cm£©²ãÎö´¿»¯£¬·Ö¹ÜÊÕ¼¯¡£
  • ø½áºÏÎïÖÊÁ¿¼ø¶¨£º
    ¿Ë·Ö×Ó±ÈÖµ²â¶¨
    øÁ¿£¨mg/ml£©=OD403¡Á0.4
    IgGÁ¿£¨mg/ml£©=£¨OD280-OD403¡Á0.3£©¡Á0.62
    ¿Ë·Ö×Ó±ÈÖµ£¨E/P£©=øÁ¿¡Á4/IgGÁ¿£¬Ò»°ãÔÚ1-2Ö®¼ä¡£Ã¸½áºÏÂÊ=øÁ¿¡ÁÌå»ý/¿¹Ì壬±ê¼ÇÂÊÒ»°ãΪ0.3-0.6£¬¼´1-2¸öHRP·Ö×Ó½áºÏÔÚÒ»¸ö¿¹Ìå·Ö×ÓÉÏ£¬±ê¼ÇÂÊ¿É´óÓÚ0.6£¬0.8£¬0.9£»OD403/OD280µÈÓÚ0.4ʱ£¬E/PԼΪ1¡£
    ±ê¼ÇÂÊ=OD403/OD280
    ø»îÐԺͿ¹Ìå»îÐԵIJⶨ¿ÉÓ¦ÓÃELISA·¨¡¢ÃâÒßÀ©É¢¡¢DAB-H2O2ÏÔÉ«·´Ó¦²â¶¨Ã¸½áºÏÎïµÄø»îÐÔ£¬¿¹Ìå»îÐÔ¼°Ð§¼Û¡¢ÌØÒìÐÔ¡£
  • HRP¿¹Ìå½áºÏÎïµÄ±£´æ£º¼ÓÈëµÈÁ¿¸ÊÓͺó£¬Ð¡Á¿·Ö×°-20¡æ´æ·Å£¬·ÀÖ¹·´¸´¶³ÈÚ£»»ò¼ÓÈëµÈÁ¿60%¸ÊÓÍ4¡æ±£´æ£»²»Ò˼ÓNaN3»ò·Ó·À¸¯£¬·ñÔò»áÓ°Ïìø»îÐÔ¡£±ØҪʱ¶³¸É±£´æ£¬ÒÔBSA»òÍÑ֬ţÄÌ×÷±£»¤¼Á¡£

2) ¼îÐÔÁ×Ëáø£¨AKP£©

¼îÐÔÁ×Ëáø£¨AKP£©ÓÃÓÚ±ê¼Ç¿¹Ì壬³£ÓÃÎì¶þÈ©Ò»²½·¨£¬½«Ã¸ºÍµ¥¿¹»ìºÏ£¬ÔÙ¼ÓÈëÊÊÁ¿Îì¶þÈ©£¬Ê¹Ã¸ºÍ¿¹Ìåµ°°×µÄNH2·Ö±ðÓëÁ½¸öÈ©»ù½áºÏ£¬ÖƱ¸³É½áºÏÎï¡£¸Ã·¨¼ò±ã£¬µ«ËùµÃ²úÎï²»¾ùÒ»£¬¿¹Ìå»îÐÔËðʧ´ó£¬Ã¸±ê¼ÇÂʵÍ¡£

²Ù×÷²½Ö裺
  • ½«5mg AKP¼ÓÈë1ml¿¹ÌåÈÜÒº£¨2mg/ml£©ÖÐÈܽ⣬װÈë͸Îö´ü£¬ÓÚ4¡æ¶Ô0.01mol/L PH7.2 PBS͸Îö18Сʱ£¬»»ÒºÈý´Î¡£
  • ¼ÓÈë2.5%Îì¶þÈ©20ul£¬ÊÒÎÂ×÷ÓÃ1-2Сʱ£¬4¡æ¶ÔPBS͸Îö¹ýÒ¹£¬Æä¼ä»»ÒºÈý´Î¡£
  • »»ÓÃ0.05mol/L PH8.0 Tris-HCl»º³åҺ͸Îö£¬4¡æ¹ýÒ¹£¬»»ÒºÈý´Î¡£
  • È¡³ö±ê¼Ç¿¹Ì壬Óú¬1%BSAµÄTris-HCl»º³åҺϡÊÍÖÁ4ml£¬¼´ÎªAKP±ê¼ÇÎïÔ­Òº¡£
  • ÿºÁÉýÖмÓÈë0.4ml¸ÊÓÍ£¬Ð¡Á¿·Ö×°£¬±£´æ±¸Óá£

2.¿¹ÌåµÄÉúÎïËØ»¯±ê¼Ç

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²Ù×÷²½Ö裺
  • ½«´ýÉúÎïËØ»¯µÄµ°°×ÖÊÓÃ0.1 mol/L̼ËáÇâÄÆ»º³åÒº£¨pH 8.0£©»ò0.5 mol/LÅðËỺ³åÒº£¨pH 8.6£©Ï¡Ê͵½1mg/ml,Ò»°ãʵÑéÊÒÓ¦ÓõÄÉúÎïËØ»¯Ìå»ýΪ1-2.5ml;
  • ½»»¥ÓÃ0.1 mol/L̼ËáÇâÄÆ»º³åÒº£¨pH 8.0£©»ò0.5 mol/LÅðËỺ³åÒº£¨pH 8.6£©£¬¶Ôµ°°×Öʳä·Ö͸Îö£»
  • ÓÃ1ml DMSOÈܽâÉúÎïËØçúçêõ£ÑÇ°·õ¥£¨NHSB£©1mg£»
  • Ïò1mlµ°°×ÖÊÈÜÒº£¨¼´º¬µ°°×ÖÊ1mg£©¼ÓÈë120¦Ìl NHSBÈÜÒº£¨¼´º¬NHSB 120 ¦Ìg£©£»
  • ÔÚÊÒÎÂϳÖÐø½Á°è£¬±£ÎÂ2-4Сʱ£»
  • ¼ÓÈë9.6¦ÌL1 mol/L NH4Cl (ÿ25 ¦Ìg NHSB ¼Ó1 ¦Ìl)£¬ÔÚÊÒÎÂϽÁ°è10·ÖÖÓ£»
  • ÔÚ4¡æ£¬¶ÔPBS³ä·Ö͸Îö£¬ÒÔ³ýÈ¥ÓÎÀëµÄÉúÎïËØ£»
  • ½«ÑùÆ·ÉÏ1mlµÄ·Ö×ÓɸÖù£¬ÒÔPBS»ºÂýÏ´ÍÑ£¬ÊÕ¼¯1ml/¹Ü£¬µ°°×ÖÊÔÚ1-3mlÖ®¼äÏ´Ï£»
  • ×îºó£¬ÑùÆ·¼ÓÈëµþµªÄÆ£¨ÖÕŨ¶È0.5g/L£©¼°1.0g/L
  • BSA¡£½«½áºÏ²úÎïÖÃ4¡æ£¬±Ü¹â±£´æ£¬Òà¿É¼ÓÈë50%ÖØÕô¸ÊÓÍ£¬ÖèD20¡æ±£´æ¡£

ʵÑéÒªµã¼°ËµÃ÷
  • ÈçÔÚ·´Ó¦»ìºÏÒºÖÐÓеþµªÄÆ»òÓÎÀë°±»ù´æÔÚ£¬»áÒÖÖƱê¼Ç·´Ó¦¡£Òò´Ë£¬µ°°×ÖÊÔÚ·´Ó¦Ç°Òª¶Ô0.1 mol/L̼ËáÇâÄÆ»º³åÒº»ò0.5 mol/LÅðËỺ³åÒº³ä·Ö͸Îö£»
  • ËùÓõÄNHSB¼°´ýÉúÎïËØ»¯µ°°×ÖÊÖ®¼äµÄ·Ö×ӱȰ´µ°°×ÖʱíÃæµÄ¦Å-°±»ùµÄÃܶȻáÓÐËù²»Í¬£¬Ñ¡Ôñ²»µ±ÔòÓ°Ïì±ê¼ÇµÄЧÂÊ£¬Ó¦ÏÈÓü¸¸ö²»Í¬µÄ·Ö×Ó±ÈÀ´É¸Ñ¡×îÊÊÌõ¼þ£»
  • ÓÃNHSBÁ¿¹ýÁ¿Ò²ÊDz»ÀûµÄ£¬¿¹Ô­µÄ½áºÏλµã¿ÉÄÜÒò´Ë±»·â±Õ£¬µ¼Ö¿¹Ìåʧ»î£»
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  • µ±ÓÎÀë¦Å-°±»ù£¨Àµ°±Ëá²Ð»ùµÄ°±»ù£©´æÔÚÓÚ¿¹ÌåµÄ¿¹Ô­½áºÏλµãʱ£¬»òλÓÚøµÄ´ß»¯Î»µãʱ£¬ÉúÎïËØ»¯»á½µµÍ»òËðÉË¿¹Ìåµ°°×µÄ½áºÏÁ¦»ò»îÐÔ¡£´Ëʱ£¬Ó¦ÊÔÓÃÆäËü½»Áª·½·¨£»
  • ÉúÎïËØ»¹¿ÉÄÜÓ벻ͬµÄ¹¦ÄÜ»ùÍÅ£¬ÈçôÊ»ù¡¢°±»ù¡¢ÛÏ»ù¡¢Òìßäßò»ù¼°±½·Ó»ù£¬Ò²¿ÉÓëÌÇ»ù¹²¼Û½áºÏ£»
  • ½»Áª·´Ó¦ºó£¬Ó¦³ä·Ö͸Îö£¬·ñÔò£¬²ÐÓàµÄÉúÎïËØ»á¶ÔÉúÎïËØ»¯¿¹ÌåÓëÇ׺ÍËصĽáºÏ²úÉú¾ºÕù×÷Óã»
  • ÔÚϸ°ûµÄÓ«¹â±ê¼ÇʵÑéÖУ¬ÖкÍÇ׺ÍËصı¾µ×µÍ£¬µ«ÓÉÓÚÁ´Ã¹Ç׺ÍËغ¬ÓÐÉÙÁ¿ÕýµçºÉ£¬¹Ê¶ÔijЩϸ°û¿Éµ¼Ö¸߱¾µ×¡£

3.¿¹ÌåµÄÓ«¹â±ê¼Ç·¨

Ó«¹â¿¹Ìå±ê¼Ç¼¼ÊõÊǽ«Ó«¹âËØÒÔ»¯Ñ§·½·¨ÓëÌØÒìÐÔ¿¹Ìå¹²¼Û½áºÏ£¬ÐγÉÓ«¹âËØ-µ°°×ÖʽáºÏÎ¼´Ó«¹â±ê¼Ç¿¹Ì壩£¬´Ë½áºÏÎïÈÔ±£Áô×Å¿¹Ìå»îÐÔ£¬Í¬Ê±¾ßÓÐÓ«¹âËصÄʾ×Ù×÷Óᣵ±ËüÓëÏàÓ¦µÄ¿¹Ô­ÌØÒì½áºÏºó£¬½èÖúÓÚÓ«¹âÏÔ΢¾µ¹Û²ì³ÊÏÖÃ÷ÁÁµÄÌØÒìÓ«¹â¡£ÊµÑéÖг£ÓÃÒìÁòÇè»ùÓ«¹â»Æ£¨fluorescein isothiocyanate, FITC£©×÷Ϊ±ê¼ÇÎÔÚ¼îÐÔÈÜÒºÖУ¬FITCÉϵĻ¯Ñ§»ùÍÅÒìÁòÇè»ù£¨-N=C=S£©Ó뿹Ìåµ°°××ÔÓÉ°±»ù£¨Ö÷ÒªÊÇÀµ°±ËáµÄ¦Å-°±»ù£©½áºÏ£¬ÐγÉÓ«¹â¿¹Ì壬ÒԲⶨϸ°ûÏàÓ¦¿¹Ô­µÄ´æÔÚ¡£FITC¾ßÓкܸߵÄÁ¿×Ó²úÁ¿£¨·¢Éä¹âÓëÎüÊÕ¹âµÄ±ÈÖµ,0 .85£©£¬¶øÇÒÐγɵÄżÁªÎïµÄÎȶ¨ÐԺܺá£FITCÊÇÓ¦ÓÃ×î¹ãµÄÓ«¹âȾÁÏ£¬Á÷ʽϸ°ûÒǾͰ´FITCµÄÌØÐÔ£¬Éè¼ÆÁ˼¤¹â²¨³¤Îª488 nm,ºÜ½Ó½üÓÚFITCµÄ×î´ó¼¤·¢²¨³¤492nm£©¡£

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  • Ó¦¾ßÓÐÄÜÓëµ°°×ÖÊ·Ö×ÓÐγɹ²¼Û½¡µÄ»¯Ñ§»ùÍÅ£¬Óëµ°°×ÖʽáºÏºó²»Ò×½âÀ룬¶øδ½áºÏµÄÉ«Ëؼ°Æä½µ½â²úÎïÒ×ÓÚÇå³ý¡£
  • Ó«¹âЧÂʸß,Óëµ°°×ÖʽáºÏºó£¬ÈÔÄܱ£³Ö½Ï¸ßµÄÓ«¹âЧÂÊ¡£
  • Ó«¹âÉ«ÔóÓë±³¾°×éÖ¯µÄÉ«Ôó¶Ô±ÈÏÊÃ÷¡£
  • Óëµ°°×ÖʽáºÏºó²»Ó°Ïìµ°°×ÖÊÔ­ÓеÄÉú»¯ÓëÃâÒßÐÔÖÊ£¬Óëµ°°×ÖʵĽáºÏÎïÎȶ¨£¬Ò×ÓÚ±£´æ¡£
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²Ù×÷²½Ö裺
  • ÓÃ̼ËáÇâÄÆ»º³åÒºpH9.8Ï¡ÊÍ¿¹ÌåΪ1-5mg/ml£¬»ò¿¹Ìå¶Ô¸Ã»º³åÒº³ä·Ö͸Îö£¬ÒÔ×ãÒÔʹÀµ°±Ëá²»½âÀ루ȥÆäÕýµçºÉ£©£¬µ«×¢Òâ±£³Ö´ó²¿·Öµ°°×ÖÊÈÔδ±äÐÔ£»
  • ½«Í¸Îö´ü·ÅÈë100ml º¬0 .1 mg/ml µÄpH9.8̼ËáÇâÄÆ»º³åÒº£¨ÐÂÅäÖÆ£©µÄÉÕ±­ÖУ¬ÓÃÂÁ²¬°üÉÕ±­ÒԱܹ⣬4¡æ½Á°è¹ýÒ¹£»
  • ÉÏÊö¿¹ÌåÒº¶ÔPBSÔÚ4¡æ͸ÎöÒÔÖÕÖ¹·´Ó¦¡£Æä¼äÖÁÉÙ¸ü»»PBSÒºÈý´Î£¬Ö±ÖÂ480nm µÄÎüÊÕΪÁ㣻
  • ¼ÓÈë0.5g/L µÄµþµªÄÆ¡£´Ëºó£¬½áºÏÎïÔÚ4¡æ±Ü¹â±£´æ£¬»ò·Ö×°ºóÔÚ£­20¡æ¶³´æ¡£
Ó«¹âżÁªÖÊÁ¿µÄ¼ì²â
  • Óñê×¼ÃâÒßÓ«¹âȾɫÊÔÑéÒԲⶨżÁªÂÊ¡£
  • »òÓÃF/PÖµ²â¶¨¶ÔÆäFITC±ê¼ÇÖÊÁ¿½øÐмø¶¨¡£
  • È¡½áºÏÎïÒº0.2ml£¬¼ÓPBS 2.8ml£¨»òÁ½Õß¾ù¸ÄÓðëÁ¿£©£¬²â¶¨ÆäA490/A280£¬²é FITC±êÖ¾ÇúÏßµÃÆäŨ¶È¦Ìg/mlÖµ£¬°´IgGµÄÏû¹âϵÊý£¨mg/mlÔ¼A280 1.2£©,¿É¼ÆËãÆäF/PÖµ£¬¼´Ã¿mg¿¹ÌåËù±ê¼ÇµÄFITCµÄ±ÈÖµ£¬ÒԴ˼ø¶¨¼°±È½Ï¸÷Åú±ê¼ÇÎïµÄÖÊÁ¿¡£
ʵÑéÒªµã¼°ËµÃ÷
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  • FITCÓëµ°°×ÖʵıÈÖµ£¨F/P£©,¿Éͨ¹ý²â¶¨495nmÓë280nmÎü¹â¶ÈÀ´¼ø¶¨¡£´Ë±ÈÖµµÄ·¶Î§Ó¦Îª£°.3£­£±.0£¨·½·¨¼ûÇ°£©£»
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  • Èç¹ûFITC£­¸´ºÏÎï¶ÔPBS͸Îö²»³ä·Ö£¬¿ÉÄÜÔì³É¸ß±¾µ×£¬¶ÔÃâÒßÓ«¹âȾɫ²úÉú¸ÉÈÅ£»
  • Èç¹û±»±ê¼ÇµÄµ°°×ÖÊÊǵڶþ¿¹Ìå»òͨÓõĵÚÒ»¿¹Ì壬Ôò´ÓÉÌÆ·¹ºÖÿÉÄܸü·½±ã¿ÉÈ¡¡£

4.ÃâÒß½ºÌå½ð±ê¼Ç¿¹Ìå¼°¼ì²â¿¹Ô­

½ºÌå½ðÊÇÒ»ÖÖ³£Óõıê¼Ç¼¼Êõ£¬ÊÇÒÔ½ºÌå½ð×÷Ϊʾ×Ù±êÖ¾ÎïÓ¦ÓÃÓÚ¿¹Ô­¿¹ÌåµÄÒ»ÖÖÐÂÐ͵ÄÃâÒß±ê¼Ç¼¼Êõ£¬ÓÐÆä¶ÀÌصÄÓŵã¡£½üÄêÒÑÔÚ¸÷ÖÖÉúÎïѧÑо¿Öй㷺ʹÓá£ÔÚÁÙ´²Ê¹ÓõÄÃâÒßÓ¡¼£¼¼Êõ¼¸ºõ¶¼Ê¹ÓÃÆä±ê¼Ç¡£Í¬Ê±ÔÚÁ÷ʽ¡¢µç¾µ¡¢ÃâÒß¡¢·Ö×ÓÉúÎïѧÒÔÖÁÉúÎïоƬÖж¼¿ÉÄÜÀûÓõ½¡£
½ºÌå½ðÔڹ⾵ºÍµç¾µÖоùΪÓÐЧµÄ±ê¼ÇÎ¿ÉÒÔ¼ì²âµ¥Ò»ºÍ¶àÖØ¿¹Ô­¡£½ºÌå½ðÔÚµç½âÖÊÖв»Îȶ¨£¬µ«±»µ°°×ÖÊ°ü±»µÄ½ºÌå½ðÊÇÎȶ¨µÄ¡£Ò»°ã³£ÓÃÃâÒßÇòµ°°×»òµ°°×A°ü±»½ºÌå½ð£¬¿É×÷±ê¼Ç¶þ¿¹½øÐÐÃâÒß¼ì²â£¬±¾·½·¨Ó¦Ó÷¶Î§¹ã£¬È¾É«ºóµÄÑùÆ·¿ÉÒÔ³¤ÆÚ±£´æ¡£

²Ù×÷²½Öè
  • ½ºÌå½ðÈÜÒºÖƱ¸
    • ³ÆÈ¡0.1g ÂȽðËáÄÆ£¬ÈܽâÓÚ1LÈ¥Àë×ÓË®ÖУ»
    • ¼ÓÈÈÖó·Ð£¬¾çÁÒ½Á°èÏ£¬Ñ¸ËÙ¼ÓÈë25mlÐÂÅäµÄ1£¥ÄûÃÊËáÄÆÈÜÒº£»
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